一种基于聚苯胺和金纳米颗粒的新型适配体电化学传感器用于抗坏血酸超灵敏和高选择性检测

蒋翠文^a，谢丽萍^a，闫飞燕^a，梁忠丹^a，梁静^a，黄克靖^b，李慧玲^a，王彦力^a，罗丽红^a，李焘^a，宁德姣^a，唐莉^a，牙禹^*a

a广西农业科学院农产品质量安全与检测技术研究所，广西南宁530007

b广西民族大学化学化工学院，南宁530008

摘要：抗坏血酸(AA)参与机体的多种生理活动，在维持和促进人体健康方面起着重要作用。因此，高灵敏、准确的AA检测是一项有意义的研究工作。本研究首次建立了一种基于适体的电化学传感器，用于AA的超灵敏和选择性测定。通过在玻碳电极上修饰聚苯胺(PANI)和金纳米粒子(AuNPs)的复合材料，制备了配体传感器。用多种分析方法对所得电极的形貌和电化学性能进行了表征。结果表明，聚苯胺具有较好的导电性能，有利于加速电子转移。AuNPs的修饰有利于信号放大，适合作为灵敏传感AA的新平台。在最优条件下，该传感器对AA在1.0～1.0×10⁵ ng/L范围内呈良好的线性关系，检出限为0.10 ng/L。该法具有良好的选择性和较高的稳定性，灵敏度较已报道的同类方法提升了2000倍以上。重要的是，该传感器成功用于实现水果、蔬菜和婴儿奶粉中AA的测定，有望成为食品领域分析的有力工具。

关键词：适配体,聚苯胺，金纳米颗粒，抗坏血酸

1.引言

抗坏血酸(AA)是一种广泛存在于新鲜水果和蔬菜中的水溶性维生素^1,2，具有抗氧化、增强免疫力和预防癌症等药理作用。因此，AA广泛用于化妆品、食品和制药行业^3,4。然而，人体不能合成AA，因此完全依赖于饮食摄入⁵。AA缺乏可导致多种疾病，如坏血病、牙龈肿胀和发炎、牙齿松动和滤泡性角化过度症^6,7。此外，抗坏血酸存在于中枢神经中，具有多种重要的生理作用⁸。因此，开发灵敏、准确的测定AA的方法具有重要的应用价值。

AA的常规分析技术包括滴定法⁹、荧光法¹⁰、流动注射法¹¹、分光光度法¹²、色谱法^13,14和电化学^15-20等。其中，电化学分析法具有分析时间短、成本低、操作简便等优点。通过查阅相关研究文献可知，新鲜水果、蔬菜和婴幼儿奶粉中的AA含量分别为0.03-0.60 mg/g、0.17-0.50 mg/g和0.40-0.80 mg/g^22,23。传统的AA电化学传感器虽然可以满足大多数真实样品检测的灵敏度要求，但由于复杂的基体背景和传感器本身的低选择性，难以实现精确的测量。因此，开发高灵敏、高选择性的电化学传感器是解决上述问题的良好途径。

适配体是人工合成的单链DNA或RNA核酸，具有成本低、亲和力高、易修饰、储存简单等特点，是制造生物传感器的适宜元素^24-26。适配体传感器作为生物传感器领域的后起之星，是利用适配体作为生物识别元件，结合与靶分子具有独特选择性结合能力的材料，有助于构建高灵敏度和选择性的生物传感器²⁷。近年来，生物传感器在电化学分析领域得到了迅速发展^28-30。由于适体传感器的性能主要受其在电极表面的固定以及电极电化学性能的影响，各种具有优异导电性、良好生物相容性、大比表面积和优异电化学活性的纳米材料(如石墨烯、金属有机框架、碳纳米管和金属氧化物纳米颗粒)已被用于构建高性能适体传感器^31-34。

为了解决电化学传感器在实际样品中检测AA的灵敏度和选择性较弱的问题。本研究将聚苯胺(PANI)和金纳米颗粒(AuNPs)的复合物固定在玻碳电极表面，构建了一种检测AA的适体传感器。聚苯胺是一种很有前途的导电聚合物，具有良好的生物相容性。其丰富的氨基也为AuNPs的固定提供了活性位点。加载AuNPs后，通过Au-S键成功加载AA适配体，构成新的生物识别层。复合结构不仅将AA适配体牢固地固定在电极表面，而且凭借其良好的导电性和较大的电活性表面积，为电化学检测提供了显著的信号放大。然后，以[Fe(CN)₆]^3-/4-为氧化还原探针构建了一种新型的AA电化学适配体传感器，其检测机理如图1所示。

由于适体具有良好的亲和性和选择性，以及PANI和AuNPs复合材料优异的电化学性能，所制备的适体传感器与已报道的AA电化学传感器相比具有高选择性、高灵敏度和宽的线性范围。以往报道的电化学传感器检测AA的检出限仅为μg/L，而该传感器的检出限可低至0.10 ng/L。同时，该传感器成功地测定了水果、蔬菜和婴幼儿奶粉样品中的AA，结果与国内使用的国标分析方法(GB 5009.86-2016，高效液相色谱法)吻合良好。上述结果充分表明了该传感器在实际应用中对AA的灵敏、选择性和准确分析的潜力。

方案1:AA配体传感器的制备过程及传感策略。

2. 实验

2.1试剂

略

2.2 仪器

电化学测试仪器的品牌：荷兰PalmSens，型号：PalmSens4C便携式电化学分析仪，由雷迪美特中国有限公司提供。

2.3 PANI和AuNPs的制备

PANI的合成是用先前报道的方法经过一些改进³⁸。具体步骤如下：将1.0 mL苯胺溶于100 mL 1.0 M HCl中得到单体溶液。再将3.10 g过硫酸钾溶于100 ml 1.0 M HCl中，形成引发剂溶液。将上述两种溶液混合搅拌30分钟后，加入200 ml去离子水停止反应。然后分别用去离子水和乙醇洗涤得到的固体，并于60℃干燥24 h，收集备用。

AuNPs的合成如下³⁹：10.0 mL 8×10^-4M HAuCl₄·3H₂O加热至沸腾。接着将0.1 mL 0.34 M柠檬酸三钠快速加入上述溶液中。将溶液加热搅拌15 min，冷却后，将得到的酒红色AuNPs保存在4℃的冰箱中备用。

2.4适配体传感器的制备

PANI在水中超声处理1h，形成均匀悬浮液(1.5 mg/mL)。同时，用氧化铝粉抛光GCE，分别在HNO₃(50%，wt %)溶液、乙醇和去离子水中超声洗涤。将5 μL制备好的PANI负载在洁净的玻碳电极上，于红外光下干燥，得到PANI/GCE。然后，通过Au和-NH-之间的共价偶联和静电作用，将5 μL AuNPs覆盖在PANI/GCE上，得到AuNPs/PANI/GCE^40,41。随后，在AuNPs/PANI/GCE表面滴5 μL适配体(5 mM)，并在37℃下孵育2 h，确保适配体与AuNPs通过Au-S键固定于电极表面，然后用Tris-HCl缓冲液(10 mM, pH 7.4)冲洗电极表面，去除非特异性吸附的适体，得到Apt/AuNPs/PANI/GCE。为了阻断剩余的活性位点，将Apt/AuNPs/PANI/GCE在MCH溶液(1 mM)中浸泡30分钟，然后用Tris-HCl缓冲液(10 mM, pH 7.4)洗涤三次，得到MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE，得到的适配体传感器保存在4℃的冰箱中备用。

2.5适配体传感器检测AA

将MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE浸入在含有5 mM [Fe(CN)₆]^3-/4-和0.1 M KCl的10 mL水溶液中，扫描电位为0 ~ 0.60 V之间，用差分脉冲伏安法(DPV)进行测试，记录0.23 V 的DPV峰值电流。然后，用Tris-HCl冲洗电极，在37℃下，在不同浓度的AA浸泡20 min，于相同条件下，用Tris-HCl洗涤后测量。AA孵育前后的峰值电流(∆I)变化由式(1)计算⁴²:

ΔI = I₀ - I₁             (1)

其中I₀为未经AA处理的MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE的峰值电流。I₁为经AA处理后的传感器的峰值电流。

2.6样品的制备

婴儿奶粉、水果和蔬菜样本均从超市购买，并在使用前进行了预处理。水果和蔬菜样品用去离子水洗涤3次并均质。将婴儿奶粉和均质的果蔬汁样品(1.0000 g)与20 mL Tris-HCl混合，超声5 min, 9000 rpm离心6 min后收集上清。为了样品提取完全，上述提取过程重复两次。收集所有上清液并将其转移到100ml容量瓶中，然后用Tris-HCl定容。提取液稀释至适当倍数后，用制备的MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE检测。在处理前，用AA的标准物质制备成浓度分别为0.1000、0.5000、1.000、5.000 mg/g 的加标样品。

2.7 HPLC测定

HPLC流动相为甲醇和50mm正磷酸二氢钾-2.5mM CTAB缓冲液（用正磷酸调节pH为2.5）。甲醇(v₁)与50 mM正磷酸二氢钾-2.5mM CTAB缓冲液(v₂)的比例为2/98 (v₁/v₂)，流速1.0 mL/min，进样量10 uL。测量在25℃的色谱柱上进行，检测器波长为245 nm。

3.结果与讨论

3.1表面形貌和结构

对制备的PANI和AuNPs进行TEM、XRD、FT-IR和N₂吸附-脱附等温线分析，结果如图1所示。TEM图像显示PANI具有棒状结构(图1A)，球形的AuNPs粒径在8 ~ 26 nm之间，平均直径为13.0 nm(图1B)。

用XRD进一步研究了PANI和AuNPs。由图1C可知，在2θ = 20°和25°处检测到两个衍射峰，分别归属于PANI (100)和(110)两个晶面⁴²，表明PANI的成功合成。在图1D中，在38.3°、44.5°、64.6°和77.7°处观察到四个峰，分别指向(111)、(200)、(220)和(311)反射面晶体结构，证明AuNPs合成成功⁴³。

苯胺和所制备的聚合物的FT-IR表征进一步证明了聚苯胺的成功制备(图1E)。在苯胺的FT-IR光谱中，3440和3360 cm^-1两个波段与-NH₂拉伸振动有关。1618和1496 cm^-1是由-NH₂的弯曲振动和苯环的C=C拉伸振动引起的。相反，根据PANI的FT-IR光谱可知，在3444 cm^-1处的特征吸收峰属于-NH-拉伸振动⁴⁴，而在1557和1481cm-1处的特征吸收峰属于类醌环和苯环的C=C拉伸振动⁴⁵。1300 cm^-1处的波段属于C-N拉伸振动，1121 cm^-1处的波段与掺杂PANI的醌类单元有关。806 cm^-1处的吸收带对应于苯环的C-H面外变形弯曲⁴⁶。以上数据证实了聚苯胺的成功合成。

利用N₂吸附-脱附等温线进一步研究了聚苯胺的孔隙度。如图1F所示，制备的聚苯胺在0.4＜P/P₀＜1.0时表现出明显的后滞环，说明中孔的存在。当P/P₀接近1.0时，曲线急剧上升，表明存在大孔隙^47,48。计算得到PANI的BET比表面积为41.07 m²/g。

图1 PANI (A)和AuNPs (B)的TEM图像。附图显示了AuNPs的大小分布。PANI的XRD谱图(C)和AuNPs (D)，苯胺和PANI的FT-IR谱图(E)， PANI的N2吸附-脱附等温线(F)。

通过SEM对修饰电极的制备过程进行了检测，结果如图2所示。与表面C元素均匀分布且表面光滑的裸GCE (图2A)相比，PANI/GCE表面呈现棒状结构，并出现N元素(图2B)，表明PANI在GCE上成功进行了修饰。添加AuNPs后，大量球形颗粒均匀地覆盖在PANI/GCE电极表面且出现了Au元素 (图2C)。然而，在添加适配体后，AuNPs/PANI/GCE表面被密集的适配体层覆盖(图2D)并出现了P元素，说明适配体成功固定。这些变化证明了采用逐层组装策略构建配体传感器的可行性。

图2裸GCE (A)、PANI/GCE (B)、AuNPs/PANI/GCE (C)和Apt/AuNPs/PANI/GCE (D)的SEM图像。附图为裸GCE、PANI/GCE、AuNPs/PANI/GCE和Apt/AuNPs/PANI/GCE中C、N、Au和P元素的元素映射图。

为了更好地了解电极的修饰过程，用XPS进行了测量。总谱图(图3A)所示，裸GCE表面只有C1s和O1s峰的存在(曲线a)，这可能是由于制备过程中表面氧化所致⁴⁹。在GCE上修饰PANI后，PANI/GCE光谱中出现C1s、O1s和N1s元素的峰(曲线b)，AuNPs/PANI/GCE光谱中出现了Au4f元素的峰(曲线c)，证明AuNPs添加成功(曲线c)。固定适配体后，N1s和O1s峰强度增大，C1s峰强度减小，是由于适配体结构N、O的含量高而C的含量低(曲线d)。P2p峰的出现是成功固定适配体的有力证据⁵⁰。

图3B(曲线a)中裸GCE的高分辨率C1s峰显示了284.7 eV (C-C)和286.1 eV (C-O)两个峰。PANI/GCE(曲线b)和AuNPs/PANI/GCE(曲线c)显示出相似的C1s峰，分别出现在284.7 eV (sp2C)、285.2 eV (sp3C)和286.2 eV (C-O / C-N) ⁵¹添加适体后，Apt/AuNPs/PANI/GCE(曲线d) 的C1s峰位置向更高的结合能方向移动(284.7,286.4和288.3eV)，这是由于适配体的固定化引入了新的基团，如N-C=O- n, C=O和N-C=N-N ⁵²。

裸GCE的N1s谱没有峰(曲线a)(图3C)，而PANI/GCE(曲线b)在399.4 eV处有一个峰，是PANI的类醌亚胺(=N-)。苯胺(-NH-)和带正电的氮(-N⁺)分别在400.0和401.0 eV ⁵³下存在。与AuNPs结合后(曲线c)，三种不同态的结合能分别移至399.5、40.1和401.8 eV，表明AuNPs与-NH-基团相互作用产生了更高的结合能^54,55。随着适配体的加入(曲线d)，与AuNPs/PANI/GCE相比，N1s的峰值位置略微向结合能更高的方向移动，这是由于适配体的嘌呤和嘧啶氮以及胺的质子化⁵²。

如图3D所示，裸GCE(曲线a)和PANI/GCE(曲线b)的高分辨率Au4f光谱中没有峰。相比之下，AuNPs/PANI/GCE(曲线c)在83.8和87.5 eV处显示出不对称的Au4f7/2和Au4f5/2峰，这表明Au纳米颗粒的存在⁵⁶。与金属Au的标准结合能值相比，Au4f7/2从84.0 eV降至0.20 eV表明AuNPs与PANI之间存在相互作用⁵⁴。结果与上述PANI中的N1s结果一致。用适配体修饰后(曲线d)，Au4f7/2峰下降到83.7 eV，相对于AuNPs/PANI/GCE位置略有移动，这是由于Au-S共价键的存在^57,58。

在图3E中，S2p光谱在168.5和169.7 eV处显示出与PANI/GCE(曲线b)和AuNPs/PANI/GCE(曲线c)相似的峰，这归因于过硫酸盐作为引发剂^38,59。适配体固定后，在结合能为161.8和162.5 eV处可见两个新的峰，与Apt/AuNPs/PANI/GCE研究的Au4f峰一致，这与Au-S键的存在有关⁶⁰。此外，裸GCE、PANI/GCE和AuNPs/PANI/GCE的P2p谱没有出现峰，而Apt/AuNPs/PANI/GCE由于适配体分子的存在，在133.65 eV处出现了磷酸峰(图3f) ⁶¹。这些数据证实了适配体在电极表面的有效组装。

图3裸GCE (a)、PANI/GCE (b)、AuNPs/PANI/GCE (c)和Apt/AuNPs/PANI/GCE (d)的总谱图(A)、C1s (B)、N1s (C)、Au4f (D)、S2p(E)和P2p (F)峰的XPS光谱。

3.2修饰电极的电化学表征

在0.025~0.200 V/s的扫描速率下，在5.0 mM [Fe(CN)₆]^3-/4-/0.1M KCl溶液中，用CV法测定了传感器的活性面积(图4A-F)。根据Randles-Sevcik方程^62,63，峰值电流可表示为:

  (2)

其中，I_p为还原峰电流(µA)， A为电极的电化学活性表面积(cm²)，C为[Fe(CN)₆]^{3 - /4 -}浓度(5.0 mM)，ν为扫描速率(V/s)，n为电子转移数(n = 1)，D为扩散系数(7.6 × 10^-6 cm²/s)。

基于I_p对ν^1/2的斜率值(图4G)，裸GCE、PANI/GCE、AuNPs/PANI/GCE、Apt/AuNPs/PANI/GCE、MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE和AA/MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE的活性面积分别为0.0838、0.135、0.140、0.0626、0.0528和0.0451 cm²。因此，用PANI和AuNPs修饰GCE后，其活性面积比裸GCE大，有利于电化学适体传感器平台的构建。而适配体固定反应后Apt/AuNPs/PANI/GCE、MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE、AA/MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE的活性面积均明显小于PANI/GCE和AuNPs/PANI/GCE，这主要是由于适配体和复合层的电导性较差所致⁶⁴。

利用电化学阻抗谱(EIS)分析了电极界面和randles等效电路的电化学信号变化。式中，CPE为恒相元件，R_ct为电荷转移电阻，R_s为电解质电阻，W₁为Warburg阻抗。如图4H所示，裸GCE呈现出一个较为清晰的半圆形，表明其电子转移电阻相对较低(曲线a约为540.9 Ω)，而由于PANI优异的导电性，PANI/GCE(曲线b)的R_ct降至112.7 Ω。加载AuNPs后，由于PANI和AuNPs的协同作用，提高了电极的有效活性面积，加速了电子转移，AuNPs/PANI/GCE的R_ct(曲线c)进一步降低至94.9 Ω。相比之下，由于适体的导电性较差，传感界面上的电子转移反应受阻，Apt/AuNPs/PANI/GCE的R_ct(曲线d)急剧增加至749.8 Ω，表明适配体已成功固定在电极表面⁵⁹。经MCH处理后，电极上剩余的活性位点被占据，导致R_ct进一步增加到942.4 Ω(曲线e)。经100 ng/L AA孵育后，由于AA-适体复合物的形成减少了电子转移，AA/MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE的R_ct增加到1287.0 Ω(曲线f)。根据式(3)⁶⁵:

   (3)

式中K⁰为非均相电子转移速率常数，R为气体常数(8.314 J/mol/K)，T为25⁰C时的开尔文温度 (298.15 K)， F为法拉第常数(96485 C/mol)， C为[Fe(CN)₆]^3-/4-浓度(5.0 mM)， R_ct为电荷转移电阻。

裸GCE、PANI/GCE、AuNPs/PANI/GCE、Apt/AuNPs/PANI/GCE、MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE和AA/MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE的K⁰分别为9.8×10^-5、4.7×10^-4、5.6×10^-4、7.1×10^-5、5.7×10^-5、4.1×10^-5cm/s。这些结果表明，用聚苯胺和AuNPs修饰GCE能有效促进界面间的电子传递，有利于电化学传感平台的构建。

图4裸GCE (A)、PANI/GCE (B)、AuNPs/PANI/GCE (C)、Apt/AuNPs/PANI/GCE (D)、MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE (E)和AA/MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE (F)在5.0 mM [Fe(CN)₆]^3-/4-/0.1 M KCl溶液中扫描速率为0.025-0.200 V/s时的CV图。(G)还原峰电流与不同电极扫描速率平方根的关系。(H)裸GCE (a)、PANI/GCE (b)、AuNPs/PANI/GCE (c)、Apt/AuNPs/PANI/GCE (d)、MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE (e)和AA/MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE (f)在5.0 mM [Fe(CN)₆]^3-/4- /0.1 M KCl溶液中的EIS图。插图为PANI/GCE (b)、AuNPs/PANI/GCE (c) 的EIS图和等效电路图。

3.3参数优化

为了提高制备的传感器的灵敏度，对可能影响AA检测的因素进行了优化，结果见ESI.†。

3.4 AA的电化学检测

在最优条件下，用MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE的测定了不同浓度AA的DPV曲线。AA浓度为1.0 ~ 1.0×10⁵ng/L (5.68×10^-12 ~ 5.68×10^-7 mol/L)下的DPV叠加曲线如图5A所示。AA浓度的增加致使MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE的DPV峰电流下降。图5B为ΔI与AA浓度对数的校准曲线。相关系数较好(R²= 0.9918)。线性回归方程为ΔI (μA) =(3.9494±0.1360)lgC (ng/L) +(12.289±0.4233)，LOD为0.10 ng/L (5.68×10^-13 mol/L) (LOD=3σ/S;σ为11个空白溶液峰值电流响应的标准差，S为校准曲线的斜率)。比较了MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE与已有AA传感器的分析性能。如表1所示，与已有的传感器相比，该传感器具有更宽的线性范围、更低的检测限和更高的灵敏度。但该适体传感器也存在制备时间长、AA与适配体结合时间长等缺点。

3.5制备的适配体传感器的重复性、稳定性和特异性

在相同的实验条件下，采用DPV法对MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE的重现性进行了评价。为此，使用5个独立制备的更新表面的适配传感器检测100 ng/L的AA。结果表明，该传感器的相对标准偏差(RSD)为4.66%，重复性好。

为了评价其稳定性，将MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE在4℃下保存一段时间。7 d后，与初始反应相比，MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE的DPV峰值电流反应未见明显下降。15天后，对于10、1.0×10²和5.0×10⁴ng/L AA的分析，该传感器仍然保持了其初始响应的85.2%、83.3%和81.6%，表明该传感器具有很高的稳定性。

为评价其特异性，对婴儿奶粉和苹果样品中常见的干扰物质进行了研究。如图6所示，500倍的CaCl₂、ZnSO₄、MgCl₂、NaNO₃、FeCl₃、KI、CuCl₂、乳糖(lac)、葡萄糖(glu)，以及相同量的VB₁、VB₆、VB₁₂、VB₉、VD₂、VD₃和VE，与AA (100 ng/L)显著的DPV电流变化相比，表现出非常微弱的信号。因此，电化学适体传感器优异的干扰性能归因于AA适配体的特异性识别能力，它能够特异性地识别和捕获目标。

3.6样品的检测

为验证MCH/Apt/AuNPs/PANI/GCE适配体传感器的可行性，对水果、蔬菜和婴幼儿奶粉样品中的AA进行了电化学检测。回收率在83.3% ~ 110.3%范围内(表2)。同时，电化学结果与HPLC检测结果(国内采用国标分析方法GB 5009.86-2016)一致，相对误差(Er)小于10%，表明所设计的方法对实际样品中AA的检测是可靠的。

采用t-检验和F-检验^38,72的统计方法对所建立的适配体传感器和高效液相色谱法所得数据进行分析。如表3所示，在95%置信水平下得到的t-和F-值均小于理论值，说明HPLC法与本文提出的AA分析方法在准确度和精密度上无显著差异。

4. 结论

设计并构建了一种检测AA的电化学适配体传感器，传感器线性范围为1.0 ~ 1.0×10⁵ng/L, LOD为0.10 ng/L。该传感器能够检测水果、蔬菜和婴幼儿奶粉样品中的AA，回收率为83.3% ~ 110.3%。与传统的AA电化学传感器相比，该传感器具有更好的分析性能，如灵敏度、线性范围和选择性。灵敏度至少比以前报道的类似方法高2000倍。所制备的适配体传感器具有良好的性能，主要归因于AA适配体良好的选择性和亲和力，以及PANI和AuNPs复合材料优异的生物相容性和电化学性能。综上所述，该传感器在AA的痕量分析中具有广阔应用潜力。

原文链接：https://doi.org/10.1039/d3ay00806a

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